Як українські вчені розфарбовують і фотографують клітини, щоб досліджувати рак молочної залози

Щоб сфотографувати білок у 5000 разів тонший за волосину, науковцю знадобиться, у кращому разі, три дні. Аби переконатися, що побачене – правда, процедуру повторюють рази чотири.

Так працюють за методом імунофлуоресценції, коли певні деталі з життя клітини "підсвічують" за допомогою флуоресцентних барвників, щоб їх дослідити. Буває, науковці діляться мікроскопічною красою в соцмережах.

Одна з них – Вікторія Косач, кандидатка біологічних наук, наукова співробітниця відділу сигнальних систем клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України. Вона досліджує поведінку клітин раку молочної залози. Такі клітини (як і будь-які пухлинні) важливо виявляти якомога раніше, щоб швидше починати лікування. Вікторія використовує імунофлуоресценцію для досліджень, а ще викладає свої світлини в Інстаграм.

Науковиця розповіла, що треба, щоб фотографувати частини клітини, як у цьому допомагає токсин блідої поганки, чи можуть вчені фотошопити і як відрізнити здорову клітину від пухлинної. 

Вікторія Косач. Фото з архіву Вікторії Косач
Далі – її пряма мова. ?

Як імунофлуоресценція допомагає вченим

Імунофлуоресцентний аналіз базується на використанні антитіл, що специфічно зв’язуються з білком-мішенню всередині клітини за принципом "ключ-замок". Це дозволяє науковцям виявити тільки той білок, що їх цікавить. До антитіл хімічно приєднують молекулу флуоресцентного барвника, свічення якої можна задетектувати за допомогою флуоресцентного або конфокального мікроскопа. Часто використання антитіл комбінують з детекцією інших небілкових молекул – нуклеїнових кислот, ліпідів, йонів, тощо – за допомогою флуоресцентних міток чи зондів, що дозволяє аналізувати одразу декілька аспектів життя клітини.

Авторське. Флуоресценція – це свічення молекули за рахунок дії на неї ультрафіолетового випромінювання або світла з певною довжиною хвилі. Наприклад, свічення хініну в тоніку під дією ультрафіолету.
Приклад флуоресценції. Таким є світіння хініну в тоніку / chem.ucla.edu

Імунофлуоресцентний метод найчастіше використовують, щоб дізнатись, у яких структурах клітини розташовується певний білок: у ядрі, мітохондріях, цитоплазмі, на мембрані, чи він пов’язаний з волокнами цитоскелету. Отримана інформація підкаже вченим, яку саме роль виконує такий білок у клітині. Це особливо важливо, якщо білок тільки відкрили і ще майже нічого про нього невідомо.

Одним з об'єктів досліджень лабораторії, в якій я працюю, є кіназа рибосомального білка S6, або скорочено – S6K1. Вона здатна додавати до інших білків у клітині фосфатну групу, змінюючи їхню структуру і таким чином "вмикаючи" або "вимикаючи" свою мішень. 

Авторське. Рибосома – органела, яка відповідає за біосинтез білків. Її порівнюють з фабрикою, що виготовляє білки на основі наявної генетичної інформації.

Саме тут нам на допомогу приходить метод імунофлуоресценції, який дозволяє "побачити" розташування S6K1 у клітинах раку молочної залози за різних умов та при дії різних ліків. Ці знання важливі для вчених, бо раніше було показано, що накопичення S6K1 у ядрах клітин може бути маркером резистентності, тобто несприйнятливості до протиракової терапії. Але механізми регуляції та причини переміщення S6K1 між ядром і цитоплазмою в клітині залишаються неповністю зрозумілими. 

Крім того, імунофлуоресцентний аналіз дозволяє дізнатись про наявність специфічних білків-маркерів у клітині, а також про можливу взаємодію декількох білків між собою. Це активно використовують в онкодіагностиці, генетиці та мікробіології. 

Який мікроскоп потрібен, щоб сфотографувати "органи" клітини

Імунофлуоресцентний аналіз неможливий без якісного мікроскопа. У нашому інституті наразі користуються лазерним скануючим конфокальним мікроскопом. У нього є чотири лазери, які забезпечують світіння різних за кольором флуоресцентних барвників і дозволяють дуже чітко обирати, який саме барвник ми хочемо змусити сигналізувати про свою присутність.

Приклад лазерного скануючого конфокального мікроскопа. З подібним працює Вікторія Косач / leica-microsystems.com

Лазери конфокального мікроскопа освітлюють лише маленьку точкову ділянку препарату, після чого флуоресценція барвника ще додатково фільтрується діафрагмою з мікроскопічним отвором, яка розташована перед детектором мікроскопа. Таким чином формується зображення однієї точки зразка в одній фокусній площині. Щоб отримати фото всього зразка, мікроскоп сканує його точка за точкою.

Такий принцип формування мікрофотографії відображений у назві цього приладу: лазерний скануючий конфокальний мікроскоп. Цей підхід дозволяє збільшити роздільну здатність, контрастність і чіткість фотографій порівняно з доступнішою ширококутною флуоресцентною мікроскопією. Різницю між цими підходами ви можете побачити на цих фото ?

Мікрофотографії клітин людини, отримані за допомогою двох різних типів мікроскопів: флуоресцентного та лазерного скануючого конфокального. Цитоскелет клітини забарвлений у червоний колір, ядра – у блакитний. Фото Вікторії Косач

Чому на фотографування білка треба витратити не менше трьох днів

Підготовка препаратів для фотографування потребує найбільше часу. Починається все з вирощування клітин. Для конфокальної мікроскопії клітини переносять на скельця товщиною приблизно 0,17 міліметра та дають час прикріпитись до них - від 24 до 48 годин. Після цього зафарбовують клітини флуоресцентними барвниками.

Якщо у нас ідеальна ситуація, коли науковець має відпрацьовану методику забарвлення або працює з відомим білком і хтось вже поділився протоколом роботи у науковій публікації, то виготовлення препаратів триватиме від одного до двох днів.

Фотографувати препарати можна наступного дня після виготовлення. Доступ до мікроскопа відбувається за графіком, а час роботи становить приблизно дві години для однієї людини. За цей час треба встигнути сфотографувати якнайбільше клітин.

Отже, за ідеальної ситуації на виготовлення та фотографування зразків треба від трьох до п’яти днів.
Співробітники Інституту молекулярної біології і генетики НАН України вивчають дані, отримані за допомогою лазерного скануючого конфокального мікроскопа. Фото надано Вікторією Косач

Такий експеримент необхідно повторити три-чотири рази і тільки за умови, що результати відтворюються в усіх або в більшості повторів, можна вважати їх достовірними.

Щоправда, наука – це про отримання нових знань. Тому частіше вчені працюють з білками, які нещодавно відкрили і відпрацьованої методики їхнього аналізу немає. І тут починається страшне: оптимізація методу імунофлуоресценції. Потрібно підібрати концентрацію барвників, час їхньої дії та низку інших параметрів. Інколи це призводить до фрустрації. Але коли методика починає стабільно працювати – почуття неймовірні! 

Як обирають барвники для фотографування частин клітини і чи можна "фотошопити" світлини

При виборі флуоресцентного барвника враховують спектр поглинання та випромінювання світла барвником, фотостабільність і взаємодію барвника з певними структурами клітини.

Спектр поглинання та випромінювання світла дозволяє науковцю спланувати, який лазер конфокального мікроскопа потрібен для роботи з барвником і в якій ділянці спектра барвник буде флуоресціювати і може бути задетектований. Якщо правильно врахувати усі спектральні характеристики, то можна використовувати одночасно багато різних барвників.

Важлива фотостабільність. Це здатність молекули барвника стабільно флуоресціювати під час циклів поглинання-випромінювання світла при роботі за мікроскопом. Що стабільніше барвник, то довше часу його можна аналізувати, а результати такого аналізу відтворюватимуться від експерименту до експерименту, що суперважливо для науковця.

Специфічність барвника визначає, з якими структурними елементами клітини він зв’язуватиметься. Наприклад, барвники Dapi та Hoechst мають спорідненість до двоспіральної ДНК, тому вони забарвлюють ядро клітини. Інша мітка з назвою MitoTracker забарвить виключно мітохондрії клітини ("клітинні електростанції", що перетворюють поживні речовини на енергію. – Авт.). Цей процес можна побачити на цій світлині ?

Конфокальна мікрофотографія клітин людини. Мітохондрії забарвлені у червоний колір, ядра клітин забарвлені барвником Dapi у блакитний колір. Фото Вікторії Косач

Для специфічного забарвлення цитоскелета клітини, а саме мікрофіламентів, науковці використовують токсин блідої поганки, який називається фалоїдин. Він проникає до живих клітин і зв’язується виключно з волокнами мікрофіламентів, стабілізуючи їх та зупиняючи процес їхнього розбирання. Це призводить до загибелі клітин, тому фалоїдин дуже токсичний для організму людини. Однак, вчені навчились використовувати токсин блідої поганки з користю для досліджень. Для цього до молекули фалоїдину хімічно додають флуоресцентну мітку, що дозволяє специфічно вивчати розподіл мікрофіламентів у клітинах. 

Так смертельно-небезпечний токсин став важливим інструментом наукової роботи. А як це виглядає, видно на цьому фото ?
Конфокальна мікрофотографія клітин людини. Мікрофіламенти забарвлені за допомогою флуоресцентно міченого фалоїдину і представлені у білому кольорі. Ядра клітин – синього кольору. Фото Вікторії Косач

Найчастіше використовують барвники, які флуоресціюють у синій, зеленій та червоній ділянках спектра. Тому найпоширеніші мікрофотографії клітин саме з таким набором кольорів.

Однак програми для редагування наукових фотографій дозволяють змінювати кольори на вибір вченого. Це називається псевдозабарвленням. Так правилом хорошого тону вважається у парі барвників зелений-червоний заміняти червоний колір на пурпуровий. Це дозволяє людям з обмеженням сприйняття кольорів краще зрозуміти, що зображено на фотографії.

Проте існують суворі правила редагування мікрофотографій, встановлені науковою спільнотою. Наприклад, не можна щось вирізати або додавати на фотографію, не дозволяється контрастувати лише якусь вибрану ділянку на фотографії, що призведе до викривлення отриманих результатів. 

Науковці, яких ловлять на недбалому редагуванні фотографій або їхній підробці, втрачають свою репутацію, а інколи й роботу. 

Як відрізнити за світлиною живу клітину від клітини-самогубці

Бувають різні типи клітинної смерті, кожен з них має свої особливості. Одним з найвідоміших різновидів клітинної загибелі є апоптоз, або клітинне самогубство. Клітина самостійно або за допомогою імунної системи запускає процеси, які призводять до її смерті.

Апоптоз відбувається під час ембріонального розвитку тварин і людини: гинуть клітини шкірних перетинок долонь і стоп, за рахунок чого формуються окремі пальчики.

За допомогою апоптозу також гинуть клітини, інфіковані вірусом, та клітини, які накопичили велику кількість пошкоджень ДНК.

Апоптичні клітини на фотографіях відрізняються за своєю будовою: вони втрачають контакт з поверхнею та сусідніми клітинами, у них руйнується частина цитоскелету, тому на ранніх етапах апоптозу вони округлюються, а на пізніх – можуть розпадатись на невеликі "бульбашки" – апоптичні тільця. Ядро таких клітин також руйнується і має вигляд окремих ущільнених фрагментів. Однак, щоб точно відрізнити апоптичні клітини від живих, існує низка барвників, що забарвлює виключно клітини на стадії самогубства. 

Конфокальна мікрофотографія клітин людини. Ядра клітин забарвлені в блакитний колір. Стрілка вказує на клітину, в якої почало руйнуватись ядро. Можна припустити, що це початок апоптозу. Однак, щоб сказати напевно, потрібно використати специфічний барвник, який зафарбовуватиме лише апоптичні клітини. Фото Вікторії Косач

Живі клітини дуже чутливі до зовнішніх умов. Тому робота з ними вимагає додаткового обладнання, що підтримуватиме стабільну температуру і ступінь кислотності середовища навіть під час вимірювання на мікроскопі. У нашому інституті такого обладнання наразі немає, тому ми вдаємось до фіксації зразків. Це означає, що на клітини наносять розчин параформальдегіду або спирту. Такі розчини вбивають клітину, але зберігають її структури максимально наближеними до стану живої. Тому на фото такі клітини, немов живі. 

Як відрізнити нормальну клітину від пухлинної

У пухлинних клітин може змінюватись форма та розмір ядра, а також форма самої клітини порівняно з нормальними побратимами. Наприклад, на фото видно, що клітини, які виробляють усі три форми білка S6K1, мають багатокутну будову та розташовуються групками. Такі ознаки властиві нормальним клітинам епітелію (покривна тканина. – Авт.) молочної залози або малорухливим клітинам раку молочної залози. Тоді, як клітини, в яких виробляється лише одна форма S6K1, що має назву р60-S6K1, кардинально змінили свою структуру: стали видовженими та поодинокими. Це одразу наштовхнуло нас на думку про збільшення їхньої здатності до руху. А подальші дослідження підтвердили це припущення. 

Тому зараз ми розглядаємо форму р60-S6K1 як важливого учасника процесу набуття пухлиною злоякісних характеристик і здатності до метастазування. 
Флуоресцентна мікрофотографія клітин раку молочної залози. Цитоплазма забарвлена в червоний колір, ядра – у блакитний. Можна помітити, що клітини, в яких виробляється лише p60-S6K1, змінили свою форму та стали менше контактувати із сусідніми клітинами. Фото Вікторії Косач

Про власні дослідження ракових клітин

Моя робота пов’язана з дослідженням ролі mTOR-S6K сигнального шляху в розвитку і прогресії раку молочної залози людини. mTOR та S6K – це білки, які забезпечують передачу сигналів від інсуліну, естрогену, гормонів щитовидної залози, а також ростових факторів та поживних речовин, чим регулюють ріст, розмір та поділ клітин.

Мутації, які призводять до підвищення активності mTOR та S6K виявляли у різних типах пухлинних клітин, зокрема і в клітинах раку молочної залози. Раніше вважалось, що такі мутації призводять до швидкого росту і надмірного поділу ракових клітин, проте згодом з’явились дані, що порушення mTOR-S6K сигнального шляху може також збільшувати рухливість клітин. Вивчити механізм впливу mTOR та S6K на здатність ракових клітин до руху і є моїм завданням.

Це важливо, бо однією з причин смерті пацієнтів від раку молочної залози є здатність пухлинних клітин рухатись та утворювати віддалені метастази.

Вони порушують функції таких органів, як мозок, печінка, легені та кістки, хірургічне втручання у які є прямою загрозою для життя людини. 

Про улюбленого "героя" фотографій

Мені подобається працювати з цитоскелетом. Він забезпечує форму клітин, їхню рухливість, бере участь у транспорті речовин та органел. Саме тому волокна цитоскелета пронизують весь внутрішній простір клітини. Часто така сітка набуває дуже цікавої форми. Тому робота з цитоскелетом завжди приносить естетичне задоволення.

Конфокальна мікрофотографія людської клітини. Ядро забарвлене у блакитний колір, волокна цитоскелета (проміжні філаменти) – у відтінки фіолетового. Фото Вікторії Косач

Спільноти, де багато красивих фото, зроблених за допомогою імунофлуоресценції

Рекомендую інстаграм-канали, які надихають мене: 

? immunofluorescence,

? p53andme,

? artofmicroscopy,

? _biochemily_

Там науковці діляться своїми флуоресцентними зображеннями, популяризують науку та розповідають про своє повсякденне життя в лабораторії.

Для естетичного задоволення відвідайте сайт щорічного конкурсу мікрофотографій: Nikon Small World та конкурсу наукових фотографій Wikimedia.

Марія Прокопенко
Для публікації коментарів потрібно авторизуватись!
Через соцмережi
Через пошту
Ви
укр
рус
© 2018 «Йод.Медia». Всi права захищенiРозроблено у Wander Black
Ми збираємо і використовуємо cookie, для того щоб формувати достовірну статистику та робити контент цікавішим для кожного з наших читачів. Що таке cookie-файли, як їх ввімкнути/вимкнути, ви можете прочитати тут.Редакція шанує авторське право, тому, якщо хочете передрукувати будь-який наш матеріал, напишіть нам сюди.
Пошук
Увiйти
Через соцмережi
Через пошту