Как украинские ученые раскрашивают и фотографируют клетки, чтобы исследовать рак молочной железы

Чтобы сфотографировать белок в 5000 раз тоньше волоса, ученому понадобится, в лучшем случае, три дня. Чтобы убедиться в увиденном, процедуру повторяют раза четыре.

Так работают по методу иммунофлуоресценции, когда определенные детали из жизни клетки "подсвечивают" с помощью флуоресцентных красителей для их исследования. Бывает, ученые делятся микроскопической красотой в соцсетях.

Одна из них - Виктория Косач, кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела сигнальных систем клетки Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины. Она исследует поведение клеток рака молочной железы. Такие клетки (как и любые опухолевые) важно выявлять как можно раньше, чтобы быстрее начать лечение. Виктория использует иммунофлуоресценцию для исследований, а еще выкладывает свои фотографии в Инстаграм.

Ученая рассказала, что нужно, чтобы фотографировать части клетки, как в этом помогает токсин бледной поганки, могут ли ученые фотошопить и как отличить здоровую клетку от опухолевой. 

Виктория Косач. Фото из архива Виктории Косач
Далее - ее прямая речь. 👇

Как иммунофлуоресценция помогает ученым

Иммунофлуоресцентный анализ базируется на использовании антител, которые специфически связываются с белком-мишенью внутри клетки по принципу "ключ-замок". Это позволяет ученым выявить только интересующий их белок. К антителам химически присоединяют молекулу флуоресцентного красителя, свечение которой можно задетектировать с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа. Часто использование антител комбинируют с детекцией других небелковых молекул - нуклеиновых кислот, липидов, ионов и т.д. - с помощью флуоресцентных меток или зондов, что позволяет анализировать сразу несколько аспектов жизни клетки.

Авторское. Флуоресценция - это свечение молекулы за счет воздействия на нее ультрафиолетового излучения или света с определенной длиной волны. Например, свечение хинина в тонике под действием ультрафиолета.
Пример флуоресценции. Так выглядит свечение хинина в тонике / chem.ucla.edu

Иммунофлуоресцентный метод чаще всего используют, чтобы узнать, в каких структурах клетки располагается определенный белок: в ядре, митохондриях, цитоплазме, на мембране, или он связан с волокнами цитоскелета. Полученная информация подскажет ученым, какую именно роль выполняет такой белок в клетке. Это особенно важно, если белок только открыли и еще почти ничего о нем неизвестно.

Одним из объектов исследований лаборатории, в которой я работаю, является киназа рибосомального белка S6, или сокращенно - S6K1. Она способна добавлять к другим белкам в клетке фосфатную группу, изменяя их структуру и таким образом "включая" ​​или "выключая" ​​свою мишень.

Авторское. Рибосома - органелла, отвечающая за биосинтез белков. Ее сравнивают с фабрикой, производящей белки на основе имеющейся генетической информации.

Именно здесь нам на помощь приходит метод иммунофлуоресценции, который позволяет "увидеть" расположение S6K1 в клетках рака молочной железы при различных условиях и при воздействии различных лекарств. Эти знания важны для ученых, потому что раньше было показано, что накопление S6K1 в ядрах клеток может быть маркером резистентности, то есть невосприимчивости к противораковой терапии. Но механизмы регуляции и причины перемещения S6K1 между ядром и цитоплазмой в клетке остаются не полностью понятными.

Кроме того, иммунофлуоресцентный анализ позволяет узнать о наличии специфических белков-маркеров в клетке, а также о возможном взаимодействии нескольких белков между собой. Это активно используют в онкодиагностике, генетике и микробиологии.

Какой микроскоп нужен, чтобы сфотографировать "органы" клетки

Иммунофлуоресцентный анализ невозможен без качественного микроскопа. В нашем институте сейчас пользуются лазерным сканирующим конфокальным микроскопом. У него есть четыре лазера, обеспечивающие свечение различных по цвету флуоресцентных красителей и позволяют очень четко выбирать, какой именно краситель мы хотим заставить сигнализировать о своем присутствии.

Пример лазерного сканирующего конфокального микроскопа. С подобным работает Виктория Косач / leica-microsystems.com

Лазеры конфокального микроскопа освещают лишь маленький точечный участок препарата, после чего флуоресценция красителя еще дополнительно фильтруется диафрагмой с микроскопическим отверстием, расположенной перед детектором микроскопа. Таким образом формируется изображение одной точки образца в одной фокусной плоскости. Чтобы получить фото всего образца, микроскоп сканирует его точка за точкой.

Такой принцип формирования микрофотографии отражен в названии этого прибора: лазерный сканирующий конфокальный микроскоп. Этот подход позволяет увеличить разрешение, контрастность и четкость фотографий по сравнению с доступной широкоугольной флуоресцентной микроскопией. Разницу между этими подходами вы можете увидеть на этих фото 👇

Микрофотографии клеток человека, полученные с помощью двух различных типов микроскопов: флуоресцентного и лазерного сканирующего конфокального. Цитоскелет клетки окрашен в красный цвет, ядра - в голубой. Фото Виктории Косач

Почему на фотографирование белка надо потратить не менее трех дней

Подготовка препаратов для фотографирования требует больше времени. Начинается все с выращивания клеток. Для конфокальной микроскопии клетки переносят на стекла толщиной примерно 0,17 миллиметра и дают время прикрепиться к ним - от 24 до 48 часов. После этого закрашивают клетки флуоресцентными красителями.

Если у нас идеальная ситуация, когда у ученого есть отработанная методика окраски или он работает с известным белком и кто-то уже поделился протоколом работы в научной публикации, то изготовление препаратов продлится от одного до двух дней.

Фотографировать препараты можно на следующий день после изготовления. Доступ к микроскопу идет по графику, а время работы составляет примерно два часа для одного человека. За это время надо успеть сфотографировать как можно больше клеток.

Итак, при идеальной ситуации на изготовление и фотографирование образцов надо от трех до пяти дней.
Сотрудники Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины изучают данные, полученные с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Фото предоставлено Викторией Косач

Такой эксперимент необходимо повторить три-четыре раза и только при условии, что результаты воспроизводятся во всех или в большинстве повторах, можно считать их достоверными.

Правда, наука - это о получении новых знаний. Поэтому чаще ученые работают с белками, которые недавно открыли и отработанной методики их анализа нет. И тут начинается страшное: оптимизация метода иммунофлуоресценции. Нужно подобрать концентрацию красителей, время их действия и ряд других параметров. Иногда это приводит к фрустрации. Но когда методика начинает стабильно работать - чувство невероятные!

Как выбирают красители для фотографирования частей клетки и можно ли "фотошопить" снимки

При выборе флуоресцентного красителя учитывают спектр поглощения и излучения света красителем, фотостабильность и взаимодействие красителя с определенными структурами клетки.

Спектр поглощения и излучения света позволяет ученому спланировать, какой лазер конфокального микроскопа нужен для работы с красителем и в каком участке спектра краситель будет флуоресцировать и может быть задетектирован. Если правильно учесть все спектральные характеристики, то можно использовать одновременно много различных красителей.

Важна фотостабильность. Это способность молекулы красителя стабильно флуоресцировать во время цикла поглощения-излучения света в работе за микроскопом. Чем стабильнее краситель, тем дольше времени его можно анализировать, а результаты такого анализа будут воспроизводиться от эксперимента к эксперименту, что суперважно для ученого.

Специфичность красителя определяет, с какими структурными элементами клетки он связываться. Например, у красителей Dapi и Hoechst есть родство к двуспиральной ДНК, поэтому они окрашивают ядро ​​клетки. Другая метка с названием MitoTracker окрасит исключительно митохондрии клетки ("клеточные электростанции", превращающие питательные вещества в энергию. - Авт.). Этот процесс можно увидеть на этой фотографии 👇

Конфокальная микрофотография клеток человека. Митохондрии окрашены в красный цвет, ядра клеток окрашены красителем Dapi в голубой цвет. Фото Виктории Косач

Для специфической окраски цитоскелета клетки, а именно микрофиламентов, ученые используют токсин бледной поганки, который называется фалоидин. Он проникает в живые клетки и связывается исключительно с волокнами микрофиламентов, стабилизируя их и останавливая процесс их разборки. Это приводит к гибели клеток, поэтому фалоидин очень токсичен для организма человека. Однако, ученые научились использовать токсин бледной поганки с пользой для исследований. Для этого к молекуле фалоидина химически добавляют флуоресцентную метку, позволяющую специфически изучать распределение микрофиламентов в клетках. 

Так смертельно опасный токсин стал важным инструментом научной работы. А как это выглядит, видно на этом фото 👇
Конфокальная микрофотография клеток человека. Микрофиламенты окрашенны с помощью флуоресцентно меченого фалоидина и представлены в белом цвете. Ядра клеток - синего цвета. Фото Виктории Косач

Чаще всего используют красители, которые флуоресцируют в синей, зеленой и красной областях спектра. Поэтому самые распространенные микрофотографии клеток именно с таким набором цветов.

Однако программы для редактирования научных фотографий позволяют менять цвета на выбор ученого. Это называется лжеокрашиванием. Так правилом хорошего тона считается в паре красителей зеленый-красный заменять красный цвет на пурпурный. Это позволяет людям с ограничением восприятия цветов лучше понять, что изображено на фотографии.

Однако существуют строгие правила редактирования микрофотографий, установленные научным сообществом. Например, можно что-то вырезать или добавлять на фотографию, не допускается контрастировать только какой-то выбранный участок на фотографии, что приведет к искажению полученных результатов. 

Ученые, которых ловят на небрежном редактировании фотографий или их подделке, теряют свою репутацию, а иногда и работу.

Как отличить по фотографии живую клетку от клетки-самоубийцы

Бывают разные типы клеточной смерти, у каждого из них есть свои особенности. Одной из самых известных разновидностей клеточной гибели является апоптоз, или клеточное самоубийство. Клетка самостоятельно или с помощью иммунной системы запускает процессы, которые приводят к ее смерти.

Апоптоз происходит во время эмбрионального развития животных и человека: гибнут клетки кожных перепонок ладоней и стоп, за счет чего формируются отдельные пальчики.

С помощью апоптоза также погибают клетки, инфицированные вирусом, и клетки, которые накопили большое количество повреждений ДНК.

Апоптические клетки на фотографиях отличаются по своему строению: они теряют контакт с поверхностью и соседними клетками, в них разрушается часть цитоскелета, поэтому на ранних этапах апоптоза они округляются, а на поздних - могут распадаться на небольшие "пузырьки" - апоптические тельца. Ядро таких клеток также разрушается и имеет вид отдельных уплотненных фрагментов. Однако, чтобы точно отличить апоптические клетки от живых, существует ряд красителей, окрашивающий исключительно клетки на стадии самоубийства.

Конфокальная микрофотография клеток человека. Ядра клеток окрашены в голубой цвет. Стрелка указывает на клетку, в которой начало разрушаться ядро. Можно предположить, что это начало апоптоза. Однако, чтобы сказать наверняка, нужно использовать специфический краситель, который будет окрашивать только апоптические клетки. Фото Виктории Косач

Живые клетки очень чувствительны к внешним условиям. Поэтому работа с ними требует дополнительного оборудования, которое будет поддерживать стабильную температуру и степень кислотности среды даже при измерении на микроскопе. В нашем институте такого оборудования пока нет, поэтому мы прибегаем к фиксации образцов. Это означает, что на клетки наносят раствор параформальдегида или спирта. Такие растворы убивают клетку, но сохраняют ее структуры максимально приближенными к состоянию живой. Поэтому на фото такие клетки выглядят, как живые.

Как отличить нормальную клетку от опухолевой

У опухолевых клеток может меняться форма и размер ядра, а также форма самой клетки по сравнению с нормальными собратьями. Например, на фото видно, что клетки, которые производят все три формы белка S6K1, имеют многоугольную строение и располагаются группами. Такие признаки присущие нормальным клеткам эпителия (покровная ткань. - Авт.) молочной железы или малоподвижным клеткам рака молочной железы. Тогда, как клетки, в которых производится только одна форма S6K1, называющаяся Р60-S6K1, кардинально изменили свою структуру: стали удлиненными и единичными. Это сразу навело нас на мысль об увеличении их способности к движению. А дальнейшие исследования подтвердили это предположение. 

Поэтому сейчас мы рассматриваем форму Р60-S6K1 как важного участника процесса получения опухолью злокачественных характеристик и способности к метастазированию.
Флуоресцентная микрофотография клеток рака молочной железы. Цитоплазма окрашена в красный цвет, ядра - в голубой. Можно заметить, что клетки, в которых производится только p60-S6K1, изменили свою форму и стали меньше контактировать с соседними клетками. Фото Виктории Косач

О собственных исследованиях раковых клеток

Моя работа связана с исследованием роли mTOR-S6K сигнального пути в развитии и прогрессии рака молочной железы человека. mTOR и S6K - это белки, которые обеспечивают передачу сигналов от инсулина, эстрогена, гормонов щитовидной железы, а также ростовых факторов и питательных веществ, чем регулируют рост, размер и деление клеток.

Мутации, приводящие к повышению активности mTOR и S6K проявляли в различных типах опухолевых клеток, в частности в клетках рака молочной железы. Ранее считалось, что такие мутации приводят к быстрому росту и чрезмерному разделению раковых клеток, однако впоследствии появились данные, что нарушения mTOR-S6K сигнального пути может также увеличивать подвижность клеток. Изучить механизм воздействия mTOR и S6K на способность раковых клеток к движению и является моей задачей.

Это важно, потому что одной из причин смерти пациентов от рака молочной железы является способность опухолевых клеток двигаться и образовывать отдаленные метастазы.

Они нарушают функции таких органов, как мозг, печень, легкие и кости, хирургическое вмешательство в которые является прямой угрозой для жизни человека.

О любимом "герое" фотографий

Мне нравится работать с цитоскелетом. Он обеспечивает форму клеток, их подвижность, участвует в транспорте веществ и органелл. Именно поэтому волокна цитоскелета пронизывают все внутреннее пространство клетки. Часто такая сетка приобретает очень интересную форму. Поэтому работа с цитоскелетом всегда приносит эстетическое удовольствие.

Конфокальная микрофотография человеческой клетки. Ядро окрашено в голубой цвет, волокна цитоскелета (промежуточные филаменты) - в оттенки фиолетового. Фото Виктории Косач

Сообщества, где много красивых фото, сделанных с помощью иммунофлуоресценции

Рекомендую инстаграм-каналы, которые вдохновляют меня: 

🔹 immunofluorescence,

🔹 p53andme,

🔹 artofmicroscopy,

🔹 _biochemily_.

Там ученые делятся своими флуоресцентными изображениями, популяризируют науку и рассказывают о своей повседневной жизни в лаборатории.

Для эстетического удовольствия посетите сайт ежегодного конкурса микрофотографий: Nikon Small World и конкурса научных фотографий Wikimedia.

Мария Прокопенко
Для публикации комментариев нужно авторизоваться!
Через социальные сети
Через почту
Вы
укр
рус
© 2018 «Йод.Медia». Все права защищеныРазработано Wander Black
Мы собираем и используем cookie для того, чтобы формировать достоверную статистику и делать контент интересным для каждого из наших читателей. Что такое cookie-файлы, как их включить / выключить, вы можете прочитать здесь.Редакция уважает авторское право, поэтому, если хотите перепечатать любой наш материал, напишите нам.
Поиск
Войти
Через социальные сети
Через почту